I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch là phương pháp xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong mô hoặc tế bào. Thông qua các kháng thể đã biết để quan sát sự tồn tại kháng nguyên ung thư trong mẫu bệnh phẩm và qua đó giúp các nhà Giải phẫu bệnh đưa ra được chẩn đoán bệnh. Trong thực tế tân sinh mô lympho ở hạch dẫn đến tình trạng hạch sung to rất khó phân biệt là u lympho ác tính hay quá sản mô lympho phản ứng hay u ung thư biểu mô di căn hạch nếu chỉ dựa trên hình ảnh mô bệnh học. Hóa mô miễn dịch giúp xác định nguồn gốc tế bào u và phân loại các típ của u lympho ác tính. Từ đó giúp cho việc điều trị đích và đánh giá tiên lượng trên lâm sàng được chính xác và hiệu quả hơn. Chính vì lí do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm xác định đặc điểm mô bệnh học và sự bộc lộ một số dấu ấn hóa mô miễn dịch trong tân sinh mô lympho ở hạch và khảo sát giá trị của kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán, phân loại u lympho ác tính không Hodgkin ở hạch.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 39 bệnh nhân được chẩn đoán là u lympho ác tính không Hodgkin hoặc hạch quá sản không điển hình nghi ngờ u lympho ác tính đến khám và điều trị tại Bệnh viện Trường Đại học Y - Dược Huế từ tháng 1 năm 2022 đến tháng 7 năm 2023.

Tiêu chuẩn chọn bệnh: Có chẩn đoán mô bệnh học là u lympho ác tính không Hodgkin và hạch quá sản không điển hình nghi ngờ u lympho ác tính.

Tiêu chuẩn loại trừ: U lympho ác tính hodgkin, U lympho ác tính không hodgkin tái phát hoặc đã điều trị trước đó (phẫu thuật, hóa trị, xạ trị).

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu nghiên cứu mô tả cắt ngang, phương pháp chọn mẫu thuận tiện.

2.3. Các bước tiến hành nghiên cứu

- Chọn đối tượng nghiên cứu

- Ghi nhận các dữ kiện hành chính, triệu chứng và chẩn đoán lâm sàng.

- Ghi nhận các dữ kiện về vị trí u, phân loại mô học theo công thức thực hành.

- Ghi nhận các xét nghiệm hóa mô với các dấu ấn miễn dịch: CD3, CD20, CD5, CD10, CD23, Bcl2, Bcl6, Ki67, CD79a và một số dấu ấn khác.

- Tất cả các trường hợp được chọn để nghiên cứu đều được thu thập số liệu dựa vào phiếu nghiên cứu.

- Phân tích số liệu

2.4. Biến số nghiên cứu

Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu; Kết quả mô bệnh học: Chẩn đoán mô bệnh học; Kết quả xét nghiệm hóa mô miễn dịch; Kết quả một số dấu ấn miễn dịch: CD3, CD20, CD79a, Bcl2, Bcl6, CD5, Ki67…Phân loại u theo dòng tế bào: Dòng tế bào B, Dòng tế bào T. Phân loại U lympho theo tiêu chuẩn của tổ chức y tế thế giới WHO [1]

2.5. Các kỹ thuật nghiên cứu

Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin- Eosin thường quy: Lấy mẫu, xử lý mẫu bệnh phẩm, đúc khuôn và cắt lát, nhuộm Hematoxylin- Eosin.

Tiêu chuẩn phân loại u lympho theo hình thái:

- Tế bào nhỏ: các tế bào u có kích thước từ 6-12μm, chất nhiễm sắc vón cục.

- Tế bào lớn: các tế bào u có kích thước từ 13-30µm, nhân không đều và có các bọng trong nhân.

- Lympho bào nhỏ nhân có khía: các tế bào u có kích thước từ 6-12μm, hình dạng nhân tế bào rất thay đổi (vặn xoắn, góc cạnh, co rúm với một hoặc nhiều khía). Chất nhiễm sắc vón cục và không có hạt nhân. Lympho bào lớn nhân có khía: các tế bào u có kích thước từ 13-30μm, nhân không đều và có bọng, hầu hết không có hạt nhân, nếu có hạt nhân thường nhỏ và không rõ.

- Lympho bào lớn nhân không khía: tế bào u có kích thước thay đổi từ 20-40μm. Nhân có bọng, có hạt nhân nhỏ không rõ và thường nằm ở màng nhân. Trong một số trường hợp hạt nhân đơn độc và nằm ở chính giữa nhưng thường không nổi bật, bào tương hẹp.

- Các tế bào nhỏ nhân không khía: là các tế bào chuyển dạng, có kích thước từ 13-20μm. Hình ảnh đặc trưng của tế bào này là có một nhân tròn với nhiều hạt nhân tròn với nhiều hạt nhân nổi rõ. Bào tương tế bào tương đối rộng và có thể nhuộm màu đậm.

- Nguyên bào miễn dịch: tế bào u có kích thước lớn hơn các tế bào lớn không khía và có hạt nhân to nằm ở trung tâm hoặc có nhiều hạt nhân bám ở ngoại vi.

- Nguyên bào lympho: các tế bào u có kích thước trung bình khoảng 15μm. Hình dạng nhân rất thay đổi trong týp tế bào nhân cuộn, hình tròn hoặc bầu dục trong týp tế bào nhân không cuộn. Chất nhiễm sắc mịn, phân bố đều. Hạt nhân thường không có và nếu xuất hiện thì thường không rõ,hoạt động nhân chia cao.

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch: Các khối nến được cắt nhuộm các dấu ấn sinh học: CD3, CD20, CD79a, CD5, CD10, CD23, Bcl2, Bcl6 và một số dấu ấn khác. Nhuộm hóa mô miễn dịch được thực hiện trên máy nhuộm hoá mô miễn dịch tự động Benchmark GX của hãng Ventana, sử dụng hoá chất của hãng Roche tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế.

Bảng 1: Kháng thể kháng các kháng nguyên đặc hiệu được sử dụng

Tiêu bản đã chuẩn bị sẽ được cho vào máy tiến hành thao tác trên máy tính với kết quả nhuộm: (1) Âm tính: chỉ có màu xanh tím của Hematoxylin nhuộm nhân tế bào; (2) Dương tính: nếu có hiện diện kháng nguyên trên tế bào, phức hợp kháng nguyên-kháng thể- Streptavidine-màu sẽ cho màu vàng nâu. Với chứng dương: Mẫu Amidal; Với chứng âm: Được tạo ra bằng cách không nhỏ kháng thể sơ cấp

2.6. Phân tích và xử lý số liệu

Tính tỷ lệ biểu hiện Ki67: Đánh giá tỉ lệ Ki67: theo phương pháp đánh giá của tác giả Ceren Boyaci và cộng sự: Ki67 biểu hiện ở nhân tế bào, việc chấm điểm được thực hiện ở độ phóng đại 400 lần tại vùng u có sự biểu hiện Ki67 cao nhất và được tính trên 200 tế bào u. [2]; Phân tích kết quả các kiểu hình miễn dịch: Phân loại kiểu hình miễn dịch U lympho theo phân loại tổ chức y tế thế giới WHO [1]; Phân tích các kết quả nghiên cứu: Tỷ lệ giới, tìm tần suất u lympho theo nhóm tuổi, phân bố theo vị trí hạch, kết quả phân loại theo dòng tế bào, tần suất bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch

Các số liệu được mã hóa, lưu trữ trên phần mềm SPSS-22, và sử dụng phần mềm này để phân tích kết quả. Thống kê mô tả: giới, nhóm tuổi, vị trí, phân loại mô bệnh học, độ ác tính, phân loại u theo dòng tế bào, sự bộc lộ của các dấu ấn miễn dịch. Tính tần số (n), tỷ lệ (%) đối với các biến số trên.

2.3. Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu được sự chấp thuận của Hội đồng Khoa học và Y đức của Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế. Theo quyết định số 1492/QĐ-BVYD Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học bệnh viện.

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Qua nghiên cứu 39 trường hợp u lympho ác tính không Hodgkin hoặc hạch quá sản không điển hình chúng tôi thu được các kết quả như sau:

Tỷ lệ giới tính nam:nữ của mẫu nghiên cứu xấp xỉ 2:1. Tuy nghiên khác biệt về tỷ lệ giới tính này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Biểu đồ 1).

Trong 39 đối tượng nghiên cứu, độ tuổi nằm trong khoảng từ 12 đến 81 tuổi. Trung vị là 54. Tuổi của mẫu nghiên cứu không có phân bố chuẩn (p<0,05) (Biểu đồ 2).

Biểu đồ 1: Phân bố bệnh nhân theo giới

Biểu đồ 2: Phân bố theo tuổi

Cổ là vị trí có hạch tổn thương thường gặp nhất (20trường hợp), tiếp đến là góc hàm (6 trường hợp), ổ bụng (5 trường hợp), nách (5 trường hợp), bẹn (1 trường hợp), trung thất (1 trường hợp) và thượng đòn (1 trường hợp) (Biểu đồ 3).

3.2. Kết quả mô bệnh học và sự bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch

Biểu đồ 3: Vị trí Biểu đồ theo phân bố theo vị trí hạch

Về phân loại mô bệnh học với mô bệnh học thường quy, chẩn đoán U lympho ác tính không Hodgkin chung chiếm 59,0%. Các hạch tổn thương được chẩn đoán là hạch quá sản không điển hình chiếm 41,0% (Bảng 2).

Bảng 2: Phân loại theo mô bệnh học

Tỷ lệ bộc lộ các dấu ấn hóa mô miễn dịch theo chẩn đoán cuối cùng

U lympho ác tính không Hodgkin: U lympho ác tính không Hodgkin dòng tế bào B dương tính hoàn toàn với các dấu ấn CD20 và CD79a (100%), tuy nhiên cũng có 1/2 ca U lympho ác tính không Hodgkin tế bào B típ nang âm tính với CD79a. CD3 âm tính toàn bộ ở nhóm U lympho ác tính không Hodgkin tế bào B và dương tính U lympho ác tính không Hodgkin tế bào T. CD30 âm tính với tất cả các trường hợp được chỉ định. U lympho ác tính không Hodgkin tế bào B lớn và B nhỏ có trung bình tỷ lệ dương tính với Ki67 từ 60-62%, riêng dòng típ nang chỉ 10%. U lympho ác tính không Hodgkin tế bào tế T có tỷ lệ dương tính với Ki67 trung bình là 63% (Bảng 3).

Bảng 3: Bộc lộ các dấu ấn hóa mô miễn dịch ở các dòng của U lympho ác tính không Hodgkin

Hạch lành tính: Các trường hợp là lành tính thuộc vào 2 nhóm chính là hạch quá sản phản ứng (10 ca) và viêm hạch hoại tử kèm quá sản phản ứng (5 ca). Các trường hợp này tất cả các dấu đều cho kết quả âm tính hoàn toàn với tế bào u, sở dĩ có kết quả dương tính do 1 số bác sĩ đọc là dương tính với tế bào phản ứng (Bảng 4).

Bảng 4: Sự bộc lộ các dấu ấn miễn dịch ở nhóm bệnh lành tính

3.3. Giá trị của kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán và phân loại u lympho ác tính không Hodgkin ở hạch

Trong 16 trường hợp được chẩn đoán hạch quá sản không điển hình trên mô bệnh học thường quy, HMMD giúp xác định 13 trường hợp là tổn thương lành tính. Trong 23 trường hợp được chẩn đoán u lympho ác tính không Hodgkin trên mô bệnh học thường quy, có 2 trường hợp được chẩn đoán lại là viêm hạch hoại tử kèm quá sản phản ứng sau HMMD. Kỹ thuật này giúp định hướng dòng tế bào và hỗ trợ phân loại u lympho ác tính. Tuy nhiên, do cỡ mẫu nghiên cứu còn nhỏ, một số phân nhóm lymphoma có số lượng rất ít nên chưa đủ giá trị đại diện, Panel dấu ấn HMMD chưa đầy đủ để phân loại sâu lymphoma theo WHO/ICC hiện nay và chưa có tiêu chuẩn đối chiếu độc lập, nghiên cứu chưa đủ cơ sở để đánh giá đầy đủ giá trị chẩn đoán của HMMD nên kết quả nghiên cứu chủ yếu mang tính mô tả và định hướng (Bảng 5).

Bảng 5: Ứng dụng của kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán và phân loại u lympho ác tính không Hodgkin ở hạch

IV. BÀN LUẬN

4.1. Đặc điểm chung

Trong 39 bệnh nhân u lympho ác tính không Hodgkin, nam giới chiếm tỷ lệ 61,5%và nữ giới chiếm 38,5% (biểu đồ 1). Tỷ lệ nam/nữ xấp xỉ 2/1. Tuy nhiên, tỷ lệ này cao hơn một số tác giả trong và ngoài nước như nghiên cứu Phạm Xuân Dũng (2012) cho thấy tỷ lệ nam/nữ là 1,4/1. Nguyễn Phi Hùng nghiên cứu 140 trường hợp u lympho không Hodgkin tại hạch (2006), Wiangnon S (2000) thì tỷ lệ nam/nữ đều là 1,5/1. Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi cũng như các tác giả trong và ngoài nước đều ghi nhận u lympho ác tính không Hodgkin là bệnh gặp ở nam giới nhiều hơn ở nữ giới [3-5]>.

Nghiên cứu của chúng tôi về tần xuất và sự phân bố u lympho không Hodgkin theo tuổicho thấy bệnh gặp ở độ tuổi từ 12 đến 81 (biểu đồ 2) trong đó độ tuổi hay gặp nhất là từ 40-60 tuổi Kết quả này phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Đình Phúc (2009) nhóm tuổi gặp nhiều nhất từ 40-59 tuổi chiếm (60%), Theo Phạm Xuân Dũng (2012) nghiên cứu 406 bệnh nhân u lympho không Hodgkin thì độ tuổi hay gặp nhất nằm trong khoảng 45-54 tuổi [4, 6].

Nghiên cứu của chúng tôi tại hạch vị trí hay gặp nhất là là hạch cổ 20/39 chiếm 51,3%, Kết này cũng tương đương kết quả nghiên cứu của Phạm Thế Vĩnh (2008) cho kết quả hạch cổ là vị trí thường gặp nhất [7].

4.2. Kết quả hóa mô miễn dịch

Về Phân loại theo dòng tế bào. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy trong các bệnh u lympho không Hodgkin, dòng tế bào B (21/24) chiếm 87,5%, dòng tế bào T (3/24) chiếm 12,5%. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đương với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Phi Hùng (u lympho tế bào B chiếm 77,1%, u lympho tế bào T 15,7%, tỷ lệ không xác định được dòng tế bào là 7,2%). Nghiên cứu của Trần Đình Hưng [8] u lympho tế bào B chiếm đa số 82,8%, u lympho tế bào T chiếm 13,8%, 3,4% các trường hợp không xác định dòng. Trần Huơng Giang 2011 (u lympho không Hodgkin tế bào B chiếm 90,5%, u lympho dòng tế bào T là 9,5%) [9]. Trong nghiên cứu của chúng tôi thì tất cả các trường hợp đều xác định được dòng tế bào, không có trường hợp nào không xác định được dòng. Như vậy, nhiều nghiên cứu đều cho thấy u lympho ác tính không Hodgkin dòng tế bào B là chiếm đa số.

Về sự bộc lộ dấu ấn CD3 trên dòng tế bào B và T. Trong nghiên cứu của chúng tôi dấu ấn CD3 bộc lộ trong u lympho không Hodgkin dòng tế bào T với tỷ lệ 100%, và mất bộc lộ của dấu ấn này với các trường hợp ulympho không hodgkin dòng B, đều này cũng giống nghiên cứu của Nguyễn Phi Hùng.Dấu ấn CD3 được sử dụng rất hữu ích trong chẩn đoán u lympho ác tính, nó là một dấu ấn theo dõi dòng hiệu quả và cung cấp thông tin đáng tin cậy cho dòng tế bào T [3].

Về sự bộc lộ dấu ấn CD20 trên dòng tế bào B và T. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy dấu ấn CD20 bộc lộ 100% trên bệnh nhân u lympho không Hodgkin dòng tế bào B, mất bộc lộ với bệnh nhân u lympho không Hodgkin dòng tế bào T. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Phi Hùng (2006) dấu ấn CD20 bộc lộ 98,25% và mất bộc lộ là 1,85% trên bệnh nhân u lympho dòng B. cũng nhiều nghiên cứu cho thấy CD20 có 1 tỷ lệ nhỏ mất bộc lộ đối với u lympho dòng B, sở dĩ nghiên cứu của chúng tối bộc lộ 100% có thể do nghiên cứu với thời gian chưa đủ dài và số lượng mẫu còn hạn chế nên chúng tôi chưa gặp trường hợp CD20 mất bộc lộ với U lympho dòng B.

Về Sự bộc lộ dấu ấn CD79a trên dòng tế bào B và T. Trong nghiên cứu của chúng tôi Dấu ấn CD79a chỉ mất bộc lộ 1 trường hợp u lympho không Hodgkin tế bào B típ nang còn lại dương tính hầu hết các bệnh nhân u lympho không Hodgkin dòng tế bào B, chiếm tỷ lệ cao 95,2%, tỷ lệ này tương đương với nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Hoàn 2015 là 95,8%, Nguyễn Phi Hùng 2006 là 98%. Dấu ấn CD79a trong nghiên cứu của chúng tôi không bộc lộ trên bệnh nhân u lympho ác tính dòng tế bào T, kết quả này cũng giống với nghiên cứu của Nguyễn Phi Hùng, Rudiger T và cộng sự, các tác giả cũng ghi nhận dấu ấn này không bộc lộ trên u lympho không Hodgkin dòng tế bào T. Tuy nhiên, trường hợp U lympho không Hodgkin tế bào B típ nang mất bộc lộ CD79a nhưng lại bộc lộ với dấu ấn CD20. Nhiều ghi nhận trong và ngoài nước thì hai dấu ấn CD20 và CD79a đã hỗ trợ lẫn nhau trong chẩn đoán và phân loại dòng tế bào, sự kết hợp cả hai dấu ấn này sẽ tránh bỏ sót u lympho dòng tế bào B và cung cấp thêm những thông tin hữu ích cho chẩn đoán và phân loại [3, 10, 11].

V. KẾT LUẬN

Hóa mô miễn dịch có vai trò quan trọng trong hỗ trợ chẩn đoán các trường hợp khó phân biệt giữa u lympho ác tính và tăng sản lympho phản ứng trên mô bệnh học thường quy. Một số trường hợp viêm hạch hoại tử kèm quá sản phản ứng có thể biểu hiện hình thái học giống lymphoma do tăng sinh lympho lan tỏa, gây khó khăn trong chẩn đoán trên tiêu bản HE. Do đó hóa mô miễn dịch hỗ trợ cho xét nghiệm mô bệnh học thường quy xác định được tổn thương lành tính hay ác tính, chẩn đoán cụ thể mặt bệnh và kiểu hình miễn dịch, hỗ trợ cho bác sĩ lâm sàng lựa chọn điều trị phù hợp.

Tuyên bố về xung đột lợi ích: Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích liên quan đến nghiên cứu và bài báo này.